Hyperstimulierendes N⁶-Methyladenin (m6A) in residualer SV40-Plasmid-DNA in modRNA-“Impfstoffen”
These data demonstrate that Pfizer/BioNTech plasmid manufacturing did not employ Dam-deficient E. coli strains. Residual plasmid DNA in mRNA vaccine preparations has been independently confirmed by several groups (Speicher et al., 2025; Kammerer et al., 2024; König et al., 2024; Wang et al., 2024). These studies demonstrate that linearized or nicked plasmid fragments can persist post-purification and retain biological activity. Combined with the present methylation data, these findings suggest that bacterially methylated DNA bearing N⁶-methyladenine (m6A) could act as a persistent agonist of the cGAS–STING pathway, contributing to innate immune stimulation or chronic inflammatory states.
In addition, Oxford Nanopore reads traversing the Eam1104I cut site revealed evidence of incomplete plasmid linearization, indicating that small amounts of circular or partially digested plasmid DNA may remain in the final product. Although the frequency of these events is likely very low, such forms could theoretically undergo re-circularization in vivo via host ligase activity. Future vaccine manufacturing should therefore consider both residual DNA load, its methylation context, and the completeness of linearization—potentially through the use of dideoxy capping or blunt-end digestion—to minimize immunostimulatory or replication-competent DNA risk.
Diese Daten zeigen, dass bei der Herstellung des Plasmids von Pfizer/BioNTech keine Dam-defizienten E. coli-Stämme verwendet wurden. Das Vorhandensein von residualer Plasmid-DNA in mRNA-Impfstoffpräparaten wurde von mehreren Gruppen unabhängig voneinander bestätigt (Speicher et al., 2025; Kammerer et al., 2024; König et al., 2024; Wang et al., 2024). Diese Studien zeigen, dass linearisierte oder geknickte Plasmidfragmente nach der Reinigung bestehen bleiben und ihre biologische Aktivität behalten können. In Kombination mit den vorliegenden Methylierungsdaten deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass bakteriell methylierte DNA mit N⁶-Methyladenin (m6A) als persistenter Agonist des cGAS-STING-Signalwegs wirken und zur Stimulierung des angeborenen Immunsystems oder zu chronischen Entzündungszuständen beitragen könnte.
Darüber hinaus ergaben Oxford-Nanopore-Reads, die die Eam1104I-Schnittstelle durchquerten, Hinweise auf eine unvollständige Plasmidlinearisierung, was darauf hindeutet, dass geringe Mengen an zirkulärer oder teilweise verdauter Plasmid-DNA im Endprodukt verbleiben können. Obwohl die Häufigkeit dieser Ereignisse wahrscheinlich sehr gering ist, könnten solche Formen theoretisch in vivo durch die Ligaseaktivität des Wirts eine erneute Zirkularisierung durchlaufen. Bei der zukünftigen Impfstoffherstellung sollten daher sowohl die Rest-DNA-Belastung als auch deren Methylierungskontext und die Vollständigkeit der Linearisierung berücksichtigt werden – möglicherweise durch die Verwendung von Didesoxy-Capping oder Blunt-End-Verdau –, um das Risiko einer immunstimulierenden oder replikationsfähigen DNA zu minimieren.