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Pharmacologically important proteins such as edible vaccines, growth factor hormones, and monoclonal antibodies have been expressed in transgenic plants. However, a low level of antigen accumulation in plants is an impediment for plant-based edible vaccination systems. Hyper-expression of foreign proteins (especially of microbial origin, up to 30% of total cellular protein) has been accomplished via chloroplast genetic engineering since chloroplasts are ideal due to their ability to process eukaryotic protein. Cholera is among the top three diseases listed by the WHO, and the mortality rate is estimated to be more than 100,000 deaths annually. Diarrhea is caused by Vibrio cholerae (diarrhea) by colonizing the small intestine and producing enterotoxin, of which the cholera toxin (CT) is considered the main cause of toxicity. The molecular structure of CT involves two subunits: toxigenic A (CTA) and B (CTB). It is now known that CTB is non-toxic and confers protection against diarrhea infection when used for vaccination purposes, unlike CTA, which is toxic.In this study, we propose to develop transgenic alfalfa plants expressing the CTB gene, which can be used in plant-based edible vaccination systems. Alfalfa can be consumed without processing (as sprouts), and vaccines produced in seeds are stable over long storage periods. We will develop a chloroplast transformation vector comprised of the CTB gene, using aadA as the selectable marker gene, a 16S rRNA promoter and a psbA terminator from the chloroplast transformation vector provided by Dr. Henry Daniell, University of Pennsylvania, and Dr. Amit Dhingra, Washington State University. Alfalfa leaves will be bombarded with the vector using the Biolistic PDS 1000/He device. Spectinomycin resistant clones will be analyzed for the presence of the CTB gene using PCR and Southern blot analysis. They will also be analyzed for the presence of CTB protein using polyclonal antibodies raised against cholera holotoxin, using Western blotting experiments.The proposed research project would also enable us to initiate collaborative research with the University of Pennsylvania, Washington State University and USDA-ARS, St. Paul, MN. Minority student participation in the proposed project would provide them "hands-on" experience in biotechnology techniques and prepare them for productive careers in food and agricultural sciences. The project will provide an opportunity to our students to conduct innovative research in one of the frontier areas of agricultural sciences. The production and success of an immuno-modulatory transmucosal carrier molecule, like cholera toxin, in chloroplast will open the way for improving the efficacy of plant based edible vaccines.

Pharmakologisch wichtige Proteine wie essbare Impfstoffe, Wachstumsfaktorhormone und monoklonale Antikörper wurden in transgenen Pflanzen exprimiert. Eine geringe Antigenakkumulation in Pflanzen ist jedoch ein Hindernis für essbare Impfsysteme auf Pflanzenbasis. Die Überexpression von Fremdproteinen (insbesondere mikrobieller Herkunft, bis zu 30 % des gesamten Zellproteins) wurde mit Hilfe der Chloroplasten-Gentechnik erreicht, da Chloroplasten aufgrund ihrer Fähigkeit, eukaryotisches Protein zu verarbeiten, ideal sind. Die Cholera gehört zu den drei von der WHO aufgelisteten Krankheiten, und die Sterblichkeitsrate wird auf mehr als 100.000 Tote pro Jahr geschätzt. Die Diarrhöe wird durch Vibrio cholerae (Durchfall) verursacht, indem es den Dünndarm besiedelt und Enterotoxin produziert, von dem das Choleratoxin (CT) als Hauptursache für die Toxizität gilt. Die molekulare Struktur des CT besteht aus zwei Untereinheiten: Toxigen A (CTA) und B (CTB). In dieser Studie schlagen wir vor, transgene Alfalfa-Pflanzen zu entwickeln, die das CTB-Gen exprimieren und in pflanzlichen, essbaren Impfsystemen eingesetzt werden können. Alfalfa kann ohne Verarbeitung (als Sprossen) verzehrt werden, und die in den Samen produzierten Impfstoffe sind über lange Lagerungszeiten stabil. Wir werden einen Chloroplasten-Transformationsvektor entwickeln, der aus dem CTB-Gen, einem 16S rRNA-Promotor und einem psbA-Terminator aus dem Chloroplasten-Transformationsvektor von Dr. Henry Daniell, University of Pennsylvania, und Dr. Amit Dhingra, Washington State University, besteht und aadA als selektierbares Markergen verwendet. Alfalfa-Blätter werden mit Hilfe des Biolistic PDS 1000/He-Geräts mit dem Vektor beschossen. Die Spectinomycin-resistenten Klone werden mittels PCR und Southern-Blot-Analyse auf das Vorhandensein des CTB-Gens untersucht. Das vorgeschlagene Forschungsprojekt würde es uns auch ermöglichen, gemeinsame Forschungsarbeiten mit der University of Pennsylvania, der Washington State University und dem USDA-ARS, St. Paul, MN, zu initiieren. Die Teilnahme von Studenten, die einer Minderheit angehören, an dem vorgeschlagenen Projekt würde ihnen praktische Erfahrungen mit biotechnologischen Verfahren vermitteln und sie auf eine produktive Laufbahn in den Lebensmittel- und Agrarwissenschaften vorbereiten. Das Projekt wird unseren Studenten die Möglichkeit bieten, innovative Forschung in einem der Pionierbereiche der Agrarwissenschaften zu betreiben. Die Herstellung und der Erfolg eines immunmodulatorischen transmukosalen Trägermoleküls, wie Choleratoxin, in Chloroplasten wird den Weg zur Verbesserung der Wirksamkeit von Pflanzenschutzmitteln eröffnen.

(Quelle: National Institute of Food and Agriculture, USA)